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Plodia飛蛾隱性白眼突變的定位和 CRISPR 同源定向修復

2022-03-09 09:58:25

Plodia interpunctella在全世界都是是儲存食品的害蟲,也是鱗翅目動物功能基因組學的一個有前途的實驗室模型系統。在這里,我們描述了對這種昆蟲進行基因組編輯的有效方法。一個自發的隱性白眼表型映射到白色基因中的一個幀移缺失(c.737delC)。白色基因的CRISPR NHEJ誘變復制了這種表型,體細胞雙等位基因敲除率高。兩只眼睛都有突變克隆的G0個體產生了100%的突變后代,使白色成為一個 在靶向其他基因時,白色是一個理想的共同轉換標記。CRISPR HDR實驗 糾正了c.737delC,并使37%的G0馬賽克成體中的白眼恢復到色素狀態。這些修復的等位基因在回交中顯示了實際的種系傳遞率。證明了該技術在基因組編輯方面的潛力。Plodia提供了一個 由于其可在實驗室中使用的特點、卵子的可注射性和可編輯性,為該類群的研究提供了一條很有前途的途徑。


結論


色素位點已被普遍用于昆蟲中,作為各種表型標記。由于它們在幼蟲階段的身體顏色和在成蟲階段的眼睛顏色容易區分。在在首次使用CRISPR/Cas9研究敲除Plodia的眼色基因時,白色基因座的外顯子被作為目標,以產生 白色基因座的外顯子被作為目標,以產生一個可遺傳的無效突變。在此,我們研究了 在此,我們通過全基因組測序,研究了在Plodia中自發的眼色突變表型的遺傳基礎,并展示了成功的工作流程。測序,并展示了一個成功的工作流程,通過 基因組編輯。具體來說,CRISPR介導的NHEJ敲除白色的結果是以相對較高的效率進行雙親體細胞編輯和種系傳遞。我們表明 用ssODN供體的HDR基因敲入有效地糾正了一個1bp的缺失,導致隱性白眼。白眼病,同樣具有很高的效率。這些數據,加上精簡和安全的飼養程序 奠定了進一步利用Plodia進行功能基因組學研究的基礎。


我們提出,白眼Pi_Fog w-/-的脫色使其成為添加顯性標記的理想選擇,如由已知在Plodia中起作用的3xP3眼睛和膠質啟動子驅動的熒光蛋白。野生型Pi_Fog可用于CRISPR實驗,其中白色基因敲除的sgRNA被共同注入,以選擇具有大克隆的創始者,這種共同轉換策略已在果蠅中使用。事實上,我們的基因敲除數據表明,100%(N=15)的G0創始者由于雙等位基因敲除而具有雙側非鑲嵌式白眼,產生100%的后代(N=1177)。換句話說,白眼表型為識別攜帶種系編輯的創始者提供了一個合適的標記,我們建議這種共轉化策略將有助于建立穩定的基因組編輯品系,因為那里很難篩選表型。Pi_Dun基因組參考文獻可以在NCBI Assembly服務器上以Pi_dt的名義隨時在線訪問,方便實驗設計。sgRNA設計中的其他考慮可以進一步促進基因組編輯。首先,瞄準一個與限制性位點重疊的序列可以使基因分型 直接了當。其次,一些報告表明,Cas9的活性得到了改善 終止于G-3'或GG-3'的sgRNA設計可以提高Cas9的活性。在這篇文章中,一個實驗者能夠在產蛋后不到60分鐘內注射數百個雞蛋。產蛋后60分鐘(AEL),在2-3小時的注射時間。值得注意的是,兩個 值得注意的是,兩個實驗者,一個收集和排列雞蛋,另一個注射和密封雞蛋,可以在產蛋后25分鐘內注射雞蛋。可以在產蛋后25分鐘內注射卵子,這應該可以減少馬賽克現象,并在需要時進一步提高 如果需要的話,這應該可以減少馬賽克,并進一步提高種系傳播率。

熒光原位雜交儀設備

我們對隱性白細胞c.737delC突變的CRISPR顯性拯救揭示了高效的基于HDR的單堿基對編輯,表明ssODN供體可被常規用于在Plodia基因組中引入小的無痕編輯。在這種應用中,一般推薦使用30 nt到90 nt的同源臂的不對稱設計,并且由于該技術可能導致的修復,所以對編輯的驗證是必要的。在這篇文章中,我們基于之前在哺乳動物細胞系中進行的單堿基替換的優化設計,使用位于PAM序列5'側或附近的ssODN,與sgRNA鏈互補,長度約為75-85 nt,兩邊有30-40 nt的同源物。根據這些發現,我們的76 nt修復模板被設計成與非目標鏈有40 nt的左同源臂和33 nt的右同源臂,在距離切割點4 nt處有一個點突變(C插入),以及一個2nt的沉默突變(CTC>TTG Leu密碼子)以防止二次切割。由于WT(獲救)等位基因是顯性的,我們用回交的方式與w -/-回交,并計算G1獲救個體的數量,作為估計嵌合體創始人中生殖細胞編輯比例的代理。在37.5%的G0個體中,我們可以檢測到眼睛中的體細胞修復,在496個G1后代中,有24.4%的個體顯示了來自HDR的拯救等位基因。這個實驗的注射是在15-60分鐘AEL進行的。如前所述,兩個實驗者在25分鐘內進行注射,可能會限制體細胞和生殖細胞的鑲嵌,并提高編輯率。優勢拯救實驗表明CRISPR方法可以在Plodia中以相對較高的效率進行的種系編輯,我們鼓勵使用和開發類似的方法,在此基礎上進行有針對性的遺傳轉化。我們鼓勵在這個系統中使用和開發類似的方法進行有針對性的遺傳轉化。


建立了完善的基因編輯實驗服務平臺,提供一體化的工業生產式技術服務,我們與國內知名研發單位合作推出完備的CRISPR/Cas9載體系統,包括單敲除、雙敲除、缺口酶、慢病毒敲除載體和敲除載體庫等體系,并且每一個載體系統都有不同的標簽(EGFP/RFP/Puro/Neo)可供選擇,能夠為客戶提供快速、準確的基因敲除項目服務。依托先進的技術和經驗豐富的科研團隊,可為客戶提供系統的CRISPR/Cas9敲除細胞系構建服務。


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